1. インストール
2. BLAST の実行方法
   • BLAST database の構築
   • 検索の実行
3. 解析例 1: Local BLAST の結果を fasta として得る
   • seqkit を使う方法
   • Batch Entrez を使う方法
4. エラーの記録

インストール

Homebrew を使ってインストールできる。たぶん brew install blast だったはず。

2017 年 9 月は、次のように NCBI からダウンロードしてインストールしたので、一応記録しておく。

1. NBCI のページ から、LATEST にゲストとして FTP で接続。
2. ウィンドウが現れるので、ncbi-blast-2.6.0+.dmg をダブルクリックして開く。フォルダ内に .pkg という拡張子の installation package があるので、これを開き指示通りにインストールする。
3. デフォルトの設定は、blast プログラムは usr/local/ncbi/blast というフォルダにインストールされる。よって path を通したり しなくてもよい。
4. または、.tar.gz で終わるファイルをダウンロードして解凍すると、そのまま blast のフォルダになる。そのフォルダにパスを通すか、コマンドのパスを指定して実行する。

なお、Linux の場合は apt-get でインストールできる。sudo apt-get install ncbi-blast+ でよい。

blast --version でバージョンが見られるかと思ったが、このコマンドは使えない。ただし、エラーメッセージとともにバージョンが表示されたので、結果的に OK だった。

BLAST の実行方法

BLAST のバージョンによって微妙に違うかもしれない。以下は少なくとも 2020 年 4 月時点、BLAST 2.10.0 で有効なコマンドである。

BLAST database の構築

file.fasta といいうファイルから、塩基配列のデータベースを構築する。アミノ酸配列の場合、dbtype は prot である。

makeblastdb -in file.fasta -parse_seqids -dbtype nucl -out databasename

makeblastdb コマンドのオプションをまとめておく。網羅はしていないので、公式マニュアル も参照のこと。

うまくいくと、6 つのファイルが作られる。塩基配列の場合、ファイル名は file.fasta.nhr, file.fasta.nin, file.fasta.nog, file.fasta.nsd, file.fasta.nsi, and file.fasta.nsq であり、アミノ酸データベースでは、file.fasta.nhr, file.fasta.nin, file.fasta.nsq, file.fasta.phr, file.fasta.pin, file.fasta.psq になるようである。

検索

まず script コマンドを実行しておくのが良いだろう。これで、ターミナルの内容がログとして記録されることになる (参考: コマンドの一覧)。

query.fasta というファイルを、database.fasta という BLAST database に対して検索する以下のコマンドが基本形。e value のオプション、output format、output file の名前を指定している。

blastn -query query.fasta -db database.fasta -evalue 1e-3 -outfmt 2 -out result.out

blast 系コマンドのオプション。基本的には、blastn、blastp など blast の種類を問わず使えるはずである。

解析例 1: Local BLAST の結果を fasta として得る

Local BLAST のデフォルトのアウトプットは、次のように blast の種類の宣言と reference から始まっている。貴重な情報ではあろうが、blast の結果を次の解析にそのまま引き渡す場合、これは少々不便である。

ここでは、BLAST の結果を fasta として得る方法を 2 つ解説する。この他にも、awk を使う方法 など、いくつも方法があるようである。

seqkit を使う方法

seqkit がない場合は、homebrew を使ってインストールする。

outfmt で 6 を指定する。6 は便利なオプションで、結果をテーブルとして出力でき、さらに何をテーブルに含めるかを指定できる。

このページ に specifier の一覧がある。今回必要なのは、subject の sequence id なので sseqid である。つまり実行するコマンドは

blastn -query query.fasta -db database.fasta -evalue 1e-3 -outfmt "6 sseqid" -out result.txt

のようになる。

result.txt には、subject sequence id が順に保存されている。これを while read line で seqkit grep に入れていけば良い。

seqkit grep -nrp ${line} original.fasta >> output.fasta

original.fasta は、blast のデータベースを作った fasta ファイルと同じである場合が多いだろう。

Batch Entrez を使う方法

かなり昔の解析例なので色々と至らない部分があるが、一応ここに載せておく。grep/findstr で開くセッション番号を探し、Batch Entrez でダウンロードする方法である。

たとえば Notch という遺伝子について、データベースにある類似の遺伝子をまとめてダウンロードしたいときの手順。

1. Query とデータベースの準備

1. NCBI から特定のキーワードで遺伝子のリストをダウンロードする。たとえば "Notch" で検索し、数千個の Notch gene の配列を notch.fasta という FASTA 形式のファイルとしてダウンロードしたとする。
2. 未知の Notch gene の配列を探すため、NCBI に登録されている全ての配列をダウンロードする。このページ の Databases から、ゲノム、トランスクリプトームなど様々なデータをダウンロードできる。既に BLAST database の形式になっているので、makeblastdb をする必要はない。

2. 検索結果から番号を抽出

3. BLAST を走らせ、結果をファイルに保存する。検索条件にもよるが、結果のファイルは数 GB になり、アプリケーションでは開けない場合も。
4. デフォルトの output format の場合、> の次に accession 番号があり、その次に alignment が続くという形式になっているはずである。
5. Windows なら findstr で、Mac なら grep で > を検索し、これを含む行だけを他のファイルに保存する。

>NM_0168731 Mus musculus gene abc, transcript
>NM_0169871 Homo sapiens gene abc, mRNA
>NM_0489412 Mus musculus gene abc, transcript

のように、番号とその他の情報がひたすら並ぶ テキストファイル になっているはずである。

この段階で、さらに特定のキーワードを使って情報を絞ることが可能だと思う。

Accession 番号とその他の情報の間にはスペースがあるので、これを Excel でスペース区切りテキストとして開くと、番号だけが最初のカラムに来る。> を置換で消去すれば、

NM_0168731
NM_0169871
NM_0489412

のように番号のみが並ぶファイルになる。

3. Batch Entrez で一括 download

6. このページ にテキストファイルをアップロードすれば、配列を一括でダウンロードすることができる。

エラーの記録

Error: Too many positional arguments (1), the offending value.

ハイフンとダッシュの問題。(キーボードによるかもしれないが)、ゼロの隣にある - を使っていることを確認する。多くの場合、どこかからコピペしたときに見られるエラー。手打ちすれば OK になるはず。

References

1. BLAST+ manual. Pdf file: Last access 2020/04/26.

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アップデート前、このページには以下のようなコメントを頂いていました。ありがとうございました。