1. イルミナシークエンシングの原理
2. Paired-end とは

イルミナシークエンシングの原理

このページでは、イルミナシークエンシングの原理と paired-end についてまとめる。いずれ、さらにページを分割するかもしれない。

イルミナシークエンシングでは、まず DNA を断片化しタグをつける (図; ref 7)。

Illumina のフローセルには、タグ配列と相補的なオリゴヌクレオチド (図; ref 8) が並んでおり...

DNA と図 (ref 9) の 1 および 2 のようにハイブリする。ここにプライマーを加え、PCR をする。

PCR で使われる dNTP は、蛍光ラベルされている。配列を読む過程を箇条書きにしてみる。

1. 蛍光ラベルした 4 種の dNTP のうち、1 種類を加える。
2. たとえば dATP を加えると、もとの配列が T であるスポットにのみ dATP の伸長反応が起こる (図, ref 10)。
3. 反応後、未反応試薬を除去し、蛍光を観察する。TT と 2 塩基連続していれば、蛍光強度も 2 倍になる。
4. 蛍光を除去し、次のサイクルへ進む。

次世代シークエンシングのポイントは、以上の反応を 4 千万個以上 (11) 並列して行えることである。これによって、短時間に大量の塩基配列を得ることが可能になる。

Paired-end とは

イルミナシークエンシングの原理の最初の図では、一つの DNA 断片の両側にタグをつけている。このような処理を行うことで、DNA を両側から読むことが可能になる。このように、両側から読む方法を paired-end sequencing という。これに対し、配列を片側からのみ読む方法は single-read sequencing と呼ばれる。

また、single-read sequencing によって決定された配列は single read, paired-end sequencing によって決定された配列は paired-end read である。

Paired-end read には、それぞれの配列自体がもつ情報に加えて、2 つの配列間の距離 という情報が含まれることになる (3)。この情報は、アセンブルやマッピングの際に有効である。例えば、以下のようなことがわかる。

• ライブラリ作製の際に DNA の長さを大体揃えるので、2 つの配列間の距離は大体どれくらいかわかる。文献 3 では「配列は 35 bp、両者の距離が 500 bp 程度」という例で説明されている。多くのイルミナ系シークエンスでは、これぐらいのオーダーと考えて良い。
• 上記の例で、2 つの配列が 1000 bp 離れて mapping された場合、その間に欠失があったことが予想される。
• この距離情報は、リピート配列に map する場合にも重要。

References

ページ分割のため本文中に引用されていないものがありますが、番号と本文は対応しています。

1. Amazon link: Pevsner 2016. Bioinformatics and Functional Genomics.
2. Amazon link: 清水、坊農 2019. 次世代シークエンサーDRY解析教本: 使っているのは第1版ですが、改訂第2版を紹介しています。
3. Paired-End Read って何ですか？ Link: Last access 2020/12/12.
4. ページ編集に伴い削除
5. ページ編集に伴い削除
6. ページ編集に伴い削除
7. By DMLapato - Own work, CC BY-SA 4.0, Link
8. By DMLapato - Own work, CC BY-SA 4.0, Link
9. By DMLapato - Own work, CC BY-SA 4.0, Link
10. By DMLapato - Own work, CC BY-SA 4.0, Link
11. イルミナシーケンサーの原理, イルミナ株式会社. Pdf file.

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